近日,金沙威尼斯欢乐娱城药学院胡琴教授和岑瑶副教授研究团队在国际知名学术期刊《核酸研究》(Nucleic Acids Research)发表了题为《FRAME:flap核酸内切酶1工程化PAM模块以精准、灵敏调控CRISPR/Cas12a的反式切割活性》(FRAME: flap endonuclease 1-engineered PAM module for precise and sensitive modulation of CRISPR/Cas12a trans-cleavage activity)的研究论文。
来源于细菌和古细菌的CRISPR系统(The clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)可以提供原核适应性免疫防御系统来降解入侵的核酸,目前已成为基因编辑、转录调控和分子诊断的革命性工具。其中,CRISPR/Cas12a系统以其精确的识别和高效的核酸切割能力而闻名,在分子诊断和生物传感领域表现出卓越的性能。以往的研究主要集中在工程CRISPR RNA(crRNA)或Cas12a蛋白来调节Cas12a系统的功能,使用的策略包括光笼化、可逆乙酰化、二聚化、环化crRNA和扩展crRNA等。然而,这些方法复杂、耗时且仅在特定条件下有效,限制了它们的应用。相反,工程化DNA链是一个更简单、更经济的选择,允许直接设计和精确编程Cas12a的反式切割活性,从而增强其生物识别和信号转导输出能力。
本研究报道了一种新的CRISPR/Cas12a系统反式切割活性工程化策略,利用Flap核酸内切酶1(Flap endonuclease 1, FEN1)来调节Cas12a双链DNA激活子中原间隔子邻近基序(Protospacer adjacent motif, PAM)模块的可及性(Flap endonuclease 1 to regulate the accessibility of the protospacer adjacent motif module in the double-stranded DNA activator, FRAME),即FRAME策略,继而精准调控Cas12a的反式切割活性。具体来说,FEN1通过识别靶输入与底物之间形成的三碱基重叠结构,从而选择性地切割并释放含有“TTTN”序列的5'-flap。该双功能flap在形成缺口PAM的同时,还触发了FEN1的二次裂解,最终实现Cas12a反式切割活性的敏感切换。FRAME策略体现了“一石二鸟”的效果,因为它不仅通过调节PAM模块的可及性精确地编程了Cas12a的活性,而且同时触发了等温循环扩增。此外,研究进一步展示了该策略在检测各种靶标中的应用,如髓过氧化物酶和miR-155,从而开发了一个敏感、特异的生物传感平台。值得注意的是,整个反应过程在37℃下进行,无需重复退火、高温条件或磁分离辅助步骤,而这些通常用于已报道的涉及FEN1的扩增反应。总的来说,FRAME策略具有显著的简单性、温和性和敏感性,为工程化Cas12a的反式切割活性引入了一个创新的概念,在医学诊断方面显示出卓越的潜力。
药学院胡琴教授、岑瑶副教授和香港中文大学(深圳)唐本忠教授、赵征教授为该论文的共同通讯作者。药学院2022级硕士研究生左铜山为该论文的第一作者。该研究得到了国家自然科学基金和江苏省青蓝工程基金项目等资助。
原文链接:https://doi.org/10.1093/nar/gkae804
(撰稿/胡琴课题组;审核/刘明捷 陈宏山)